Electrophorèse de protéines

Principe (à venir)

Préparation des réactifs au labo

Réactifs Préparation Conservation Vol/binôme
Solution tampon tampon tris-hippurate pH 8,8
1 sachet dans 1L ED
1 mois t° ambiante En fonction de la cuve: 120 ou 70mL, en prévoir +
Rouge ponceau prêt à l'emploi ou à diluer TP de l'année 20mL
Solution de décoloration

Acide acétique à 5%
prévoir 2L
pour 1L: 50mL acide + 950mL ED

Indéfini 300mL
Solution de transparisation Pour 100mL: 75mL méthanol
20mL acide acétique
5mL diacétone alcool
1 an Au bureau: 300mL
produit toxique

Préparation du blanc d'oeuf

Placer un blanc d'oeuf de poule dans 200mL ED
Mélanger puis filtrer.

Distribuer aux élèves dans un verre de montre.

blancoeuf

Préparation des bandes d'acétate de cellulose
Si le sachet n'est pas ouvert: conservation très longue (plusieurs années). Un fois entamé, les bandes du sachet sont immergées dans une solution de méthanol à 35% et conservées à + 4°C. Je les conserve ainsi d'une année sur l'autre sans en perdre.
conservationbandes
Juste avant le TP essuyer le nombre de bandes adéquat entre 2 feuilles de sopalin, les immerger dans la solution tampon pendant 30mn.
matoselectro

 

Protocole élève

 Les bandes d’acétate de cellulose ont été immergées dans du tampon pH=8,8 pendant 30 mn

Préparer les cuves

Disposer la cuve comme sur la fiche jointe,  sortir le portoir de bande et placer la solution tampon dans chaque compartiment.

 

 

Placer  2 feuilles d’essuie-tout  sur la paillasse. Sécher la  bande d’acétate de cellulose distribuée  sans mettre les doigts dessus en repliant l’essuie tout et disposer la sur le portoir (voir fiche jointe), fixer la avec les languettes "fixes-bande",  l’angle coupé en bas à droite. Vous pouvez toucher les extrémités. La bande doit être bien tendue et parallèle à l’armature. Vous devez centrer la bande. L’angle coupé se trouve vers la cathode.

Réaliser le dépôt de blanc d’œuf. Tremper l’applicateur dans la cupule contenant le blanc d’œuf et déposer sur la bande, déjà en place sur son support, sous le milieu de la bande  (voir schéma) en prenant garde que la bande soit bien horizontale et que l'échantillon ne coule pas.

Fermer le capot, brancher les fils de connexion à l’alimentation. Appeler le professeur pour la vérification puis brancher le générateur au secteur en vérifiant, paramètres 160V et 20mA. Mettre en marche, le voyant vert indique un passage du courant.

Laisser migrer pendant 42mn.
Stopper l'alimentation , débrancher le fil du secteur, débrancher les fils de connexion de la cuve.
 
Avant la fin de la migration (2 mn) , verser la totalité du colorant rouge ponceau dans la partie « fond » de la boîte fournie.
Après la migration, sortir le porte –bande, conserver son orientation, détacher la bande avec la pince :conserver son orientation et la placer dans la cuve de colration.

 ATTENTION IL FAUT CONSERVER LE SENS DE LA BANDE TOUT AU LONG DES ETAPES QUI SUIVENT

 Coloration : Faire tremper la bande dans une solution de rouge ponceau  pendant 1min30 à 2mn en effectuant des mouvements circulaires de la cuve.La bande doit être totalement immergée. Remettre en versant  le colorant dans son flacon en maintenant la bande avec une pince. Bien essuyer la pince.

 Décoloration : Avec la solution décolorante : réaliser 3 bains successifs :

Le premier bain est rapide : 1 mn, cela sert à éliminer le colorant. Effectuer des mouvements circulaires de la boîte,  vider dans l'évier (maintenir la bande avec la pince) et recommencer.
Le second bain: 4 mn, procédure identique
Réaliser le 3ème bain : identique au précédent et vider le contenu de la cuve.
La bande doit être blanche, sauf les protéines qui sont colorées en rouge.

coloration  dcoloration phase1  dcoloration dernier bain 
 coloration  décoloration début  décoloration dernier bain

 Transparisation : Appeler le professeur pour obtenir le transparisant. Le bain dure environ 1 min. La bande se ramollit. La bande est sortie du bain avec la pince et est déposée sur le couvercle de la boîte. Noter votre N°.

Faire un dessin rapide de la bande: noter le lieu du dépôt, les zones de migration, les pôles de la bande (+/-)

Séchage à l’étuve à 50°C pendant 15 min.

aprs transparisation aprs sechage
transparisation après séchage

resultat eleves

 

Une bande d’électrophorèse a été scannée. Lire les résultats avec le logiciel Mesurim.

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