Extraction et dosage du glycogène dans un organe

Matériel
Matériel /binôme Matériel au bureau
5 g de foie de veau et 5 g de muscle de boeuf
2 bechers renforcés de 250mL
2 spatules- 1 marker- 1 chronomètre
Portoir + 7 tubes à essais
+ 6 tubes à centrifuger à bouchons rouges
1 bec électrique + grille + pince en bois
1 pipette en verre de 5mL + poire
2 pipettes plastiques de 3mL
Ethanol 95°
Mixer
Balance
Na2SO4 + spatule-Acide acétique à 4%+ pipette 2mL
Centrifugeuse
Lugol + micro pipette de 50µL
1 seule micro pipette de 100µL à faire tourner en
changeant à chaque fois le cône jaune.
Poste mobile
EXAO Atelier Scientifique + colorimètre Color 1A

Le foie et le muscle sont broyés à tour de rôle (lavage du mixer) à raison de 5 g d'organe + 17,5mL d'eau déminéralisée/binôme, je compte une portion de plus.
Par exemple pour 7 binômes: 40g d'organe + 140 mL d'eau. On ne peut faire tourner le mixer: trop long. Broyer le muscle dans un mortier relève d'un tour de force.
N'ayant pas eu le temps de mesurer la densité du foie et du muscle, j'ai considéré que dans 25 g du mélange: eau + organe: il y avait 5 g d'organe.
Ce paramètre sera à modifier pour l'an prochain.
Protocole
  1. Mettre en marche le bec électrique position 500
  2. Venir, au bureau avec le becher de 250mL, prendre de l'organe mouliné : 25g à peser (tare de la balance *) du mélange eau + organe
  3. Ajouter une spatule de Na2SO4, 2mL d'acide acétique à 4%( à défaut d'acide trichloracétique); mélanger rapidement pendant 10s.
  4. Porter à ébullition en remuant avec la spatule pendant 3mn, lorsque l'ébullition débute baisser le bec électrique à 400.
  5. Poser le becher avec la pince en bois sur la grille sur la paillasse, attendre de pouvoir le tenir à la main.
  6. Remplir en versant délicatement 2 tubes à centrifuger au même niveau (équilibre de la centrifugeuse*)–Boucher- Identifier vos tubes- Centrifuger à 4200tours/mn pendant 5mn
  7. Récupérer le surnageant sans prélever du culot avec 1 pipette de 3mL en plastique des 2 tubes dans un tube à essai en notant de le volume final de surnageant.

Diaporama, cliquer sur une image

Dosage
Dans 3 tubes à essais, introduire dans l'ordre:

Tube 1: témoin Tube 2: muscle Tube 3: foie
Eau déminéralisée (mL) 4 3,9 3,9
Surnageant (µL) 0 100 100
Lugol (µL) 50 50 50
Noter les résultats visuels de la coloration dans les tubes.
Transvaser les tubes 2 et 3 dans des cuves de colorimétrie
Sur le poste mobile; lire à 470nm, le zéro a été réalisé. Lire la DO (densité optique) sur l'écran ou sur le colorimètre, et avec l'outil pointeur,trouver la valeur du taux de glycogène en g/L (2 décimales) sur la droite d'étalonnage.
Calculer la masse de glycogène dans les 5 g d'organe.

Calcul
Concentration lue sur la droite d'étalonnage C (g/L)
Volume total de la cuve V (L)
Quantité de glycogène dans la cuve C x V (g)
Volume total de surnageant recueilli V1 (L)
Volume de surnageant introduit dans la cuve V2 (L)
Quantité de glycogène dans l'échantillon Q=C x V x V1/V2 (g)
Le volume du Lugol n'est pas compté, surcharge les calculs en décimales de façon insignifiante, j'ai considéré le volume de la cuve à 4mL soit 0,004L.
La méthode n'est pas précise: il n'est pas évident de récupérer tout le volume de cuisson pour l'indroduire dans les tubes de centrifugation, le volume de surnageant récupéré n'est pas précis.
Avantage: les quantités utilisées permettent de faire seulement 2 tubes/organe/binôme: on gagne du temps dans la centrifugation.
glyco eleve

Mise en évidence du glycogène sans dosage.
Dans un autre tube, placer 2 mL (pipette plastique)du surnageant et ajouter 4mL(pipette plastique) d'alcool à 95°: le liquide se trouble, flocons blanchâtres = présence de glycogène.
Transvaser dans un tube à centrifuger – Boucher-Identifier le
Centrifuger à 4200 tours/mn pendant 5mn.
Eliminer le surnageant par renversement dans l'évier, le glycogène est dans le culot: blanc sous forme de grain.
Dissoudre le glycogène en ajoutant 4mL d'eau , puis ajouter 1 goutte de Lugol.
Faire un témoin sur de l'eau.
La présence de glycogène se traduit par une coloration acajou.
Les culots de centrifugation peuvent être séchés au four pendant 24h et ensuite pesés si on pris soin de peser les tubes vides.
On peut déduire la masse de glycogène dans l'échantillon.
Le glycogène récupéré est conservé au frigo à +4°C pour les TP : activité enzymatique
glyco3 glyco
tubes pour le dosage en colorimétrie mise en évidence du glycogène avec l'alcool
0221 0251 0261
2ème centrifugation, le glycogène est dans le culot dissolution du glycogène avec de l'eau coloration au Lugol